得益于Protein A 親和填料
對抗體的高選擇性和體積去除率以及
穩(wěn)健的雜質去除效果。
Protein A 親和填料作為抗體藥生產的行業(yè)標準
由于Protein A結合能力的局限性以及與Protein A樹脂相關的高成本，提高填料使用壽命的需求變得尤為重要。一般認為Protein A 填料的重復使用壽命由填料水解和填料污垢兩個因子所影響。
Protein A填料水解是指配基長時間暴露在清潔溶液(如氫氧化鈉)中的降解。Protein A填料污垢是由于使用無效清洗液導致雜質在填料表面不斷積累導致。
填料配基水解(hydrolysis)
將全新的填料用不同濃度的堿性溶液循環(huán) >250 小時來檢測Protein A配基的水解速率，評估不同氫氧化鈉的濃度和溫度，用填料的DBC的下降數(shù)據(jù)來指征Protein A的填料水解速率。從圖1 中可看到，高濃度的氫氧化鈉導致更高的配基水解速率，此外低溫能緩解一定的配基水解。
圖1，氫氧化鈉濃度和溫度對DBC的影響
以上數(shù)據(jù)表明在低溫條件下可緩解配基水解速率，不同分子的DBC對低溫具有不同的敏感性。以7個模型蛋白作為代表來研究不同分子在不同溫度下的DBC，其中分子B是pI為7.9的Fc融合蛋白，其余為pI范圍為6.5-8.9的IgG1單克隆抗體。如圖2，可以看到不同分子對低溫有不同程度的載量降低，這在一定程度上將抵消低溫下對配基水解帶來的好處。同時，在生產過程中在冷環(huán)境內進行Protein A層析清晰步驟還可能在層析柱上產生放氣效應(outgassing)，不利于生產制造，所以低溫下氫氧化鈉清洗并不是理想的解決方案。
圖2，使用添加劑來延緩配基的水解
選定不同的添加劑對配基水解具有不同的延緩效果，以分子E為代表，分別添加蔗糖、乙二醇和丙二醇作為氫氧化鈉的添加劑，評估其清潔液循環(huán)之后的DBC。由圖3可知，添加劑對配基水解的延緩有一定的作用，丙二醇/蔗糖和乙二醇的配體穩(wěn)定性分別比0.1 M NaOH的基礎情況提高了2倍和3倍。
圖3，比較堿性清潔溶液和
非堿性清潔溶液的填料污垢
選定3種分子(1個單抗+2個Fc融合蛋白)做為代表研究填料清洗后的污垢。為了最大程度上污染層析柱，3個代表分子的澄清收獲液在Protein A的層析柱上進行10個cycle，每個cycle只做到洗脫步驟，沒有做層析柱清潔，最后將層析柱拆下來分裝，分別用不同清洗液在不同溫度下孵育2小時，并用平衡液清洗3次，用原始的填料作為對照。此時填料上殘余的是清洗不干凈的污垢。將最后的填料懸浮液稀釋到1倍的SDS PAGE loading buffer中，80℃孵育10分鐘后取上清并進行SDS PAGE分析。SDS PAGE上越多蛋白表示越多的清洗不干凈的污垢。
從圖4中可以清楚地看出，0.1M和0.3M(泳道2、4、5)濃度較高的氫氧化鈉作為清潔溶液的效果明顯優(yōu)于0.02M (泳道3)。這一趨勢在所有3種測試分子中都是一致的。0.3M NaOH對分子A的反應優(yōu)于0.1M NaOH，但對其他兩種情況的反應相當。此外，pH 11非堿清洗液(泳道 6)對分子A的清洗效果良好，但對其他分子的清洗效果不佳。這支持了無堿清洗液不適合作為平臺清洗策略的理論。有趣的是，溫度并沒有影響樹脂清洗的效率。在更高濃度的氫氧化鈉(0.3M)下，在環(huán)境溫度和低溫(泳道4和5)下都獲得了類似的結果。
圖4
為了更好表征清洗時間對清洗效果，繼續(xù)以分子B為代表(Fc融合蛋白，pI 7.9), 用B分子污染的填料分別不同孵育時間。如圖5所示，隨著孵育時間增加，泳道的蛋白越少，清洗效果越好。但是增加孵育時間可能導致更多的配基降解，所以孵育時間和配基降解應該綜合考慮以取得最佳的填料壽命。
圖5，填料壽命研究
根據(jù)以上數(shù)據(jù)，選定0.1 M NaOH和0.1 M NaOH+20% EtGly為清潔溶液，評估其使用次數(shù)。由圖6可知，在添加了20% EthGly情況下層析柱壽命幾乎翻了一倍，且產品質量未見下降。使用乙二醇作為添加劑來清潔親和層析柱會導致洗脫體積隨著循環(huán)數(shù)增加而緩慢增加，洗脫體積不影響相應的產品質量，所以乙二醇任然可以作為親和層析的清潔添加劑。
圖6
百林科Protein A 親和層析介質MaXtar® ARPA，采用的高耐堿性的蛋白A配基，具有完全的自主知識產權，采用創(chuàng)新的綠色化學成球工藝、偶聯(lián)方式、配基，具有卓越的耐堿性能。在每個循環(huán)均使用0.5M NaOH，15min進行CIP處理，運行200個cycle以后，其動態(tài)結合載量(DBC)依然保留其原始載量的90%以上。
圖7
參考文獻：
Zhang J, Siva S, Caple R, Ghose S, Gronke R. Maximizing the functional lifetime of Protein A resins. Biotechnol Prog. 2017 May;33(3):708-715. doi: 10.1002/btpr.2448. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28218470.
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